¿Qué es una reacción en cadena de la polimerasa (pcr)? datos sobre pruebas, pasos y utilizados para

¿Qué es la PCR (reacción en cadena de la polimerasa)?

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que se utiliza para amplificar pequeñas cantidades de ADN (y en algunos casos, ARN) ubicadas en o sobre casi cualquier líquido o superficie donde se pueden depositar hebras de ADN. La clave para comprender la PCR es saber que cada ser humano, animal, planta, parásito, bacteria o virus contiene material genético como secuencias de ADN (o ARN) (secuencias de nucleótidos o piezas de ADN o ARN) que son exclusivas de su especie, y al miembro individual de esa especie. En consecuencia, si una muestra contiene segmentos de ADN o ARN, la PCR es un método utilizado para amplificar (hacer muchas copias más idénticas) de estas secuencias únicas para que puedan usarse para determinar con una probabilidad muy alta la identidad de la fuente (un persona específica, animal u organismo patógeno) del rastro de ADN o ARN que se encuentra en o sobre casi cualquier muestra de material.

Sin embargo, la amplificación por PCR es solo una parte de la prueba de identificación. Una vez que se realiza la amplificación (ver más abajo), los segmentos amplificados deben compararse con otros segmentos de nucleótidos de una fuente conocida (por ejemplo, una persona, animal u organismo patógeno específico). Esta comparación de segmentos únicos a menudo se realiza colocando secuencias de nucleótidos generadas por PCR junto a secuencias de nucleótidos conocidas de humanos, patógenos u otras fuentes en un gel de separación. La corriente eléctrica pasa por el gel y las diversas secuencias de nucleótidos forman bandas que se asemejan a una "escalera" de acuerdo con su carga eléctrica y tamaño molecular. Esto se denomina electroforesis en gel. Bandas o "escalera" como pasos que migran a los mismos niveles en el gel muestran identidad de secuencias de nucleótidos. Este método es una de las formas más populares de completar las pruebas de PCR (ver Fig. 1).

Figura 1, Bandas o "escalera" como pasos de PCR producidos ADN de Mycobacterium (cortesía de los CDC)

Figura. Elementos repetitivos (Rep) –PCR (A) y patrones de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) (B) de aislados de Mycobacterium cosmeticum de 2 pacientes en Ohio y 1 paciente en Venezuela. Rep-PCR se realizó utilizando BOXA1R cebador (3), y PFGE se realizó con la enzima de restricción AseI. Carriles 1, 2, Ohio aísla OH1 y OH2; carriles 3, 4, cepas de control ATCC BAA-878T y ATCC BAA-879; carril 5, aislado venezolano VZ1. Los estándares de tamaño de ADN son 100 pb (S1) y marcador de 48.5 kb (S2).

¿Cómo se realiza la PCR (reacción en cadena de la polimerasa)?

En 1983, Kary Mullis descubrió los pasos básicos para amplificar las secuencias de ADN. Él y Michael Smith recibieron el Premio Nobel por desarrollar este procedimiento en 1993. Hay algunos pasos básicos que se siguen en secuencia; La PCR se puede hacer en un solo tubo con productos químicos apropiados y un calentador especialmente diseñado. Los reactivos o productos químicos necesarios son los siguientes:

• Una muestra que contiene una secuencia de nucleótidos (de sangre, cabello, pus, raspado de piel, etc.)
• Cebadores de ADN: ADN corto monocatenario que se une a secuencias de nucleótidos que promueve la síntesis de una cadena complementaria de nucleótidos
• ADN polimerasa: una enzima que, cuando el ADN tiene un cebador unido, desciende por el segmento de ADN que une los bloques de construcción de ADN para formar pares de bases complementarias y, por lo tanto, sintetiza una cadena de nucleótidos complementaria de ADN (la introducción de una ADN polimerasa resistente al calor, Taq polimerasa, derivada de bacterias resistentes al calor, mejoró notablemente la capacidad de realizar PCR)
• Un gran exceso de bloques de construcción de ADN denominados nucleótidos (adenina, timidina, citosina y guanina, abreviados como: A, T, C y G, respectivamente) están presentes en la solución. Cuando estos bloques están unidos entre sí, forman una secuencia de nucleótidos o una sola cadena de ADN. Cuando estos bloques de construcción se unen a su bloque de construcción complementario mediante enlaces de hidrógeno débiles (por ejemplo, A solo se unirá con T y G solo con C), se forma una secuencia de nucleótidos de ADN complementaria y se une al ADN monocatenario original. Cuando se completa la unión, se forma un ADN de doble cadena complementario en una secuencia específica.

La PCR, entonces, comienza con un segmento de ADN de una muestra que se coloca en un tubo con los reactivos enumerados anteriormente. La solución se calienta al menos a 94 ° C (201, 2 ° F); este calor rompe los enlaces de hidrógeno que permiten que se formen cadenas de ADN complementarias, por lo que solo existen cadenas simples en la mezcla (esto se denomina desnaturalización del ADN de doble cadena).

La mezcla se deja enfriar a aproximadamente 54 ° C (129, 2 ° F). A esta temperatura, los cebadores de ADN y la ADN polimerasa se unen al ADN monocatenario individual (esto se denomina recocido del ADN). Debido a que los bloques de construcción están en exceso (alta concentración) en la mezcla, la polimerasa los usa para hacer nuevas cadenas complementarias de ADN (denominada extensión del ADN) y este proceso es más rápido a 72 C (161.6 F). Este proceso crea una nueva molécula de ADN de doble cadena a partir de cada una de las cadenas individuales de la molécula original.

Este ciclo se repite aproximadamente 40 veces en una máquina denominada ciclador térmico que repite automáticamente los ciclos de calentamiento y enfriamiento, y la cantidad de cada secuencia de ADN se duplica cada vez que se completa el ciclo de calentamiento y enfriamiento. Lo que inicialmente era un solo segmento corto de ADN puede amplificarse a aproximadamente 100 mil millones de copias después de 40 ciclos de duplicación.

¿Por qué un médico ordenaría una prueba de PCR (reacción en cadena de la polimerasa)?

La prueba de PCR forma la base de una serie de pruebas que pueden responder muchas preguntas médicas diferentes que ayudan a los médicos a diagnosticar y tratar a los pacientes. Por ejemplo, las pruebas de PCR pueden detectar e identificar organismos patógenos en pacientes, especialmente aquellos que son difíciles de cultivar (por ejemplo, VIH y otros virus y ciertos hongos).

Otros médicos ordenan pruebas de PCR para ayudar a diagnosticar enfermedades genéticas, mientras que otros médicos usan PCR para detectar relaciones biológicas, como la identificación de padres de niños. Las pruebas de PCR también se utilizan para identificar y caracterizar mutaciones genéticas y reordenamientos encontrados en ciertos tipos de cáncer.

Sin embargo, las pruebas de PCR se han modificado y extendido a muchos aspectos de las investigaciones científicas, incluida la biología evolutiva, las huellas genéticas, las investigaciones forenses y muchas otras.

¿Qué es la RT-PCR?

RT-PCR es una prueba de PCR diseñada para detectar y medir ARN. Aunque las pruebas iniciales de PCR amplificaron el ADN, muchos virus y otros componentes biológicos (por ejemplo, mitocondrias) utilizan ARN como material genético. RT-PCR difiere de la PCR convencional al tomar ARN y convertir la cadena de ARN en una cadena de ADN. Esto se realiza esencialmente por el mismo método para PCR descrito anteriormente con la excepción de usar una enzima denominada transcriptasa inversa en lugar de la ADN polimerasa. La transcriptasa inversa permite que una cadena sencilla de ARN se traduzca en una cadena complementaria de ADN. Una vez que se produce esa reacción, el método de PCR de rutina se puede utilizar para amplificar el ADN. RT-PCR se ha utilizado para detectar y estudiar muchos virus de ARN.

La RT-PCR no debe confundirse con otra variación de la PCR, denominada PCR en tiempo real. La PCR en tiempo real es una variación de la PCR que permite el análisis del ADN amplificado durante los 40 ciclos habituales del procedimiento. Aunque el procedimiento es similar a la PCR convencional con ciclos, la PCR en tiempo real utiliza tintes fluorescentes unidos a algunos de los bloques de construcción o pequeñas cadenas de nucleótidos. Dependiendo del método utilizado, la fluorescencia ocurre cuando se forman las cadenas de ADN amplificadas. La cantidad de fluorescencia se puede medir a lo largo de los 40 ciclos y permite a los investigadores medir productos específicos y sus cantidades durante los ciclos de amplificación. Esto a menudo permite a los investigadores o técnicos de laboratorio omitir la electroforesis en gel u otros procedimientos secundarios necesarios para el análisis de los productos de PCR, produciendo así resultados más rápidos.

La PCR en tiempo real y la RT-PCR son variaciones o modificaciones de la prueba de PCR original. Sin embargo, existen muchas más variaciones (al menos 25) que existen y se utilizan para resolver problemas específicos. Todos tienen diferentes nombres, como PCR de ensamblaje, PCR de arranque en caliente, PCR multiplex, PCR de fase sólida y muchos otros.

Es probable que la PCR continúe siendo modificada para ayudar a responder cualquier otra pregunta en medicina, biología. y otros campos de estudio.